关键酶(T细胞淋巴瘤：两种关键酶)

T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma, TCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)的一种类型, 发病率约占NHL的10%, 具有种族及地域特性、异质性、侵袭性强、恶性程度高和疗效差的特点。目前, 关于TCL的发病机制尚未明确。据文献报道, 氧化/抗氧化失衡在淋巴瘤发生、发展中扮演重要的角色, 其中醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1, NQO1]与血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)是抗氧化应激相关的蛋白。

NQO1是机体内一种调节氧化还原状态的胞质酶, 在维持细胞稳态中具有重要作用]; Lajin等研究发现, NQO1蛋白第6外显子(C609T)的多态性通过改变蛋白质编码氨基酸的序列, 可增加细胞发生癌变的几率; 多项研究结果显示, NQO1蛋白异常表达与乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关, 为临床预后不良的独立风险因素。

HO-1为血红素分解代谢的限速酶, 诱导血红素降解为胆绿素/胆红素, 一氧化碳(CO)和Fe2+; HO-1具有抗炎、抗氧化应激、抑制细胞凋亡等作用; 国外多项研究表明, HO-1在多种肿瘤细胞中高表达, 且与肿瘤的发生发展、化疗抵抗、肿瘤转移和预后不良密切相关。目前, 国内外有关NQO1和HO-1的表达与TCL临床参数间的研究尚未见报道。本研究探讨NQO1与HO-1在TCL中的表达及其临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2012年12月至2018年5月甘肃省人民医院经病理活检首次确诊的61例TCL患者的临床资料, 其中男性34例, 女性27例, 中位年龄47.0岁。根据2016年世界卫生组织(WHO)淋巴组织肿瘤分类, 病理分型包括:结外NK/T细胞淋巴瘤-鼻型(extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type, ENKTL)33例、ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma, ALK-negative, ALK-ALCL)8例、ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma, ALK-positive, ALK+ALCL)6例、外周T细胞淋巴瘤-非特指型(peripheral T- cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS)7例、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic lymphadenopathy, AITL)4例, 肠病相关T细胞淋巴瘤(enteropathy type T cell lymphoma, EATL)2例, 皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(subcutaneous panniculitis like T cell lymphoma, SPTCL)1例。同期取20例反应性增生淋巴组织作为对照。入组患者均未行放化疗等抗肿瘤治疗, 诊断依据《淋巴瘤病理诊断》标准。标本经10%中性福尔马林固定, 常规石蜡包埋, 连续切片, 片厚4 μm, 经H & E染色后病理活检确诊。

1.2 方法

采用免疫组织化学SP两步法检测TCL中NQO1和HO-1的表达。兔抗人NQO1多克隆抗体、兔抗人HO-1多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司, 检测步骤严格按说明书操作, NQO1和HO-1抗体的稀释浓度分别为1:400和1:800。结果判定:每张切片随机观察5个高倍视野(×400)行细胞计数, 阳性结果以阳性细胞百分率与染色强度之积进行判定(由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法阅片)。阳性细胞百分率:0~5%计0分, 6%~25%计1分, 26%~50%计2分, 51%~75%计3分, 76%~100%计4分。细胞染色强度:未染色计0分, 弱染色(淡黄色)计1分, 中度染色(棕黄色)计2分, 强染色(棕褐色)计3分。两项得分乘积:0分为阴性; 1~12分为阳性, 其中1~4分为弱阳性(+), 5~8分为中度阳性(++), 9~12分为强阳性(+++)。本研究全部患者均知情同意并获甘肃省人民医院伦理委员会批准。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。定性资料采用χ2检验或Fisher确切概率法, Spearman等级相关检验分析两样本间相关性。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学法检测TCL中NQO1和HO-1的表达

NQO1和HO-1的阳性表达主要位于细胞质, 散见于细胞核, 呈淡黄色或棕褐色颗粒(、), 在TCL组织中表达的阳性率分别为31.15%(19/61)、65.57% (40/61), 分别高于对应的反应性增生淋巴组织5.00% (1/20)、10.00%(2/20), 差异具有统计学意义(P < 0.05, ; P < 0.01, )。

2.2 NQO1和HO-1的表达与TCL患者临床病理特征的关系

NQO1与HO-1的表达均与TCL患者的临床分期、B症状有关(P < 0.05), 且临床分期越晚(Ⅰ~Ⅱ期vs.Ⅲ~ Ⅳ期), 表达的阳性率越高, 差异具有统计学意义(P < 0.01);存在骨髓侵犯的患者, HO-1的阳性表达率高于无骨髓侵犯的患者(P < 0.05);二者表达与患者的性别、年龄、LDH水平及病理分型无关(P>0.05, )。

2.3 TCL组织中NQO1和HO-1表达的关系

Spearman相关分析统计显示, TCL中NQO1与HO-1蛋白的表达存在相关性(r=0.264, P < 0.05, )。

3 讨论

TCL是一组源自T淋巴细胞的异质性疾病, 为NHL的罕见类型, 与B细胞NHL相比, TCL具有更高的侵袭性与恶性程度。TCL经典治疗方案(CHOP方案为环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+强的松)的完全缓解率可达24%~40%, 但多数患者因对化疗敏感性差致使复发、耐药频发, 除了分期较早、肿瘤负荷少的某些类型和ALK+ALCL预后较好之外(5年生存率约为71%~100%), 其余的5年生存率不足30%。有研究报道, 氧化/抗氧化失衡可能与淋巴瘤的发生、发展相关, 其中NQO1和HO-1在TCL中的表达及其临床资料间的关系未见报道。因此, 本研究从氧化应激的角度初步探讨NQO1和HO-1对TCL发生、发展的作用及意义。

NQO1是一种黄素酶,由Siegel等于1958年首次报道, 此黄素蛋白在人体组织中广泛存在, 主要表达于细胞质中。NQO1以NAD(P)H为受体, 催化醌类及其衍生物, 避免其损伤细胞并保护机体免受致癌物作用。

目前, 较多的研究集中于NQO1基因多态性与环境等多因素的交互作用致使大肠癌、前列腺癌、急性白血病等恶性肿瘤的易感性增加。越来越多的研究表明, NQO1在非小细胞肺癌、胰腺癌、肾上腺癌、甲状腺癌, 乳腺癌, 卵巢癌和子宫内膜癌等多种实体肿瘤中过表达。

Dinkovakostova等研究表明, NQO1可以保护细胞免受细胞毒性醌的侵袭, 但是NQO1的过表达与恶性肿瘤进展呈正相关。目前, 尚未明确NQO1与TCL之间的关系。本研究显示, 与对照组相比, TCL组NQO1表达的阳性率较高, 且主要位于细胞质中, 这与既往NQO1在多种恶性肿瘤中高表达的研究结果相一致, 提示NQO1可能参与TCL的进展。进一步分析NQO1高表达率与TCL患者临床病理特征的关系, 发现NQO1的过表达与患者的临床分期和B症状密切相关, 即NQO1高表达的患者具有临床分期晚和有全身侵犯倾向的特点。Li等研究发现, NQO1可当作肿瘤选择性的靶点, 并强调其不受抑癌基因, 如p53或Rb的控制及细胞周期的影响; 同时提出NQO1是人和小鼠胰腺癌抗肿瘤作用中的关键因素, 监测NQO1酶的活性并治疗NQO1过表达的患者可能获取最大疗效并产生较少的不良反应。Yang等研究结果显示, NQO1可作为乳腺癌初步诊断及预后预测评估的生物学标志物。因此, 推测NQO1的持续异常激活可能促进TCL的发生发展。

血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血红素分解代谢中的限速酶, 有3种同工酶:HO-1、HO-2和HO-3, 其中HO-1为诱导型, 又称“热休克蛋白32 (heat shock proteins 32, HSP32)”, 主要分布于肝、脾、骨髓等组织。HO-1基因的调控可通过下述几种信号通路介导:氧化应激激活Nrf2/HO-1轴诱导HO- 1的表达、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径中ERK和P38的诱导以及NO依赖性的机制等。Loboda等研究表明, 在内、外源性有害刺激作用下, HO-1作为体内重要的抗氧化酶, 通过其酶解产物(胆红素、CO)发挥抗氧化、抑制细胞凋亡、调节炎症、促进血管生成等保护作用。而近些年研究发现, HO- 1具有“双重作用”, 在正常细胞中, HO-1的表达可防止DNA受损, 避免肿瘤发生; HO-1的过度激活, 可增加瘤细胞的抗凋亡能力并促进瘤细胞的生长, 刺激肿瘤血管生成, 诱导瘤细胞侵袭、迁移。国外研究显示, HO-1在结肠癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌和胶质瘤等多种瘤细胞中高表达, 且与肿瘤的发生发展、化疗抵抗、肿瘤转移及预后不良密切相关。在本研究中, 65.57%的TCL中HO-1蛋白过表达, 这与国内外HO-1在多种实体肿瘤中过表达的研究报道一致, 且HO-1表达与肿瘤的临床分期、B症状、骨髓侵犯密切相关, 提示HO-1可能增强TCL细胞的侵袭力, 促进TCL的恶性进展与肿瘤转移。

通过分析TCL组织中NQO1和HO-1的表达水平发现, 二者间存在良好的相关性(r=0.264, P < 0.05), 考虑可能在调控二者表达的多种机制之间存在交叉, 从而协同发挥作用。研究显示, NQO1和HO-1存在共同的诱导因子, 如Nrf2可通过Nrf2/Keap1信号通路诱导其表达, 但二者之间的表达是否可以直接相互影响, 尚待深入研究。本研究的不足之处在于纳入的部分患者随访时间较短, 未能进一步开展生存分析及预后评估。因此, NQO1和(或)HO-1的高表达是否提示TCL患者的不良预后, 还有待深入研究。而且, 本研究为回顾性分析, 样本量相对较少, 存在局限性, 需要进一步前瞻性研究和长期随访来验证研究结果, 从而阐明NQO1和HO-1在TCL发生发展中的分子机制。

综上所述, NQO1和HO-1作为重要的抗氧化应激反应相关的蛋白, 二者在TCL组织中高表达, 其中NQO1与TCL临床分期、B症状有关, HO-1和TCL的临床分期、骨髓侵犯、B症状密切相关, 提示NQO1和HO-1可能参与TCL的发生、发展过程。

参考文献：

张婧, 薛丽, 党雅梅, 赵凤辉, 李红玲. NQO1和HO-1在T细胞淋巴瘤中的表达及意义[J]. 中国肿瘤临床

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